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文章速递LncRNA SNHG9敲除对胶质瘤细胞增殖影响及其作用机制的生物信息学探讨 认领
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作者 叶静静 陈天兵 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第3期342-347,共6页
目的利用CRISPR-Cas9结合流式单细胞分选构建lncRNA SNHG9基因敲除的U251细胞株,检测基因敲除对细胞增殖能力的影响。利用生物信息学分析探讨SNHG9基因发挥功能的可能机制。方法在SNHG9基因上、下游分别设计一个Cas9作用靶点,将两对单... 目的利用CRISPR-Cas9结合流式单细胞分选构建lncRNA SNHG9基因敲除的U251细胞株,检测基因敲除对细胞增殖能力的影响。利用生物信息学分析探讨SNHG9基因发挥功能的可能机制。方法在SNHG9基因上、下游分别设计一个Cas9作用靶点,将两对单链向导RNA的引物模板退火连接px330-EGFP载体,构建成功的目的质粒共转染U251细胞后,通过流式单细胞分选在96孔板中培养,通过PCR扩增和测序验证筛选得到SNHG9敲除成功的单克隆细胞株并扩大培养。RTCA方法检测SNHG9敲除后细胞增殖能力的改变。利用在线工具分析lncRNA SNHG9的表达情况,查找共表达基因并进行富集分析。结果构建成功用于SNHG9敲除的质粒。培养共存活了8个克隆,且得到1株SNHG9成功敲除的细胞株。敲除细胞的增殖能力明显降低(P<0.05)。分析显示SNHG9在胶质母细胞瘤(GBM)组织中高表达,富集分析显示共表达基因主要与线粒体的功能相关。结论成功建立了SNHG9敲除的克隆细胞株且能抑制U251细胞的增殖,生物信息学分析显示SNHG9可能参与线粒体的功能调控。 展开更多
关键词 CRISPR-Cas9 SNHG9 胶质瘤 细胞增殖 生物信息学分析
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文章速递SRSF9基因敲除胶质母细胞瘤细胞株基因回补及其功能研究 认领
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作者 汪京京 张真豪 +3 位作者 穆会君 龚玲丽 邹健 殷莹 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第4期550-555,共6页
目的在CRISPR/Cas9敲除SRSF9基因的胶质母细胞瘤U87单克隆株中进行SRSF9基因回补并进行回补功能研究。方法构建SRSF9-WT过表达载体并同义突变sgRNA1靶序列上的5个碱基构建SRSF9-sgMu过表达载体并包装成慢病毒,感染U87 SRSF9基因敲除单... 目的在CRISPR/Cas9敲除SRSF9基因的胶质母细胞瘤U87单克隆株中进行SRSF9基因回补并进行回补功能研究。方法构建SRSF9-WT过表达载体并同义突变sgRNA1靶序列上的5个碱基构建SRSF9-sgMu过表达载体并包装成慢病毒,感染U87 SRSF9基因敲除单克隆细胞,构建SRSF9基因回补细胞株。利用Western blot和免疫荧光实验验证回补蛋白的定位,利用增殖和肿瘤干细胞成球实验验证回补基因的拯救功能。结果成功构建SRSF9-WT和SRSF9-sgMu过表达载体并包装成慢病毒。Western blot和免疫荧光实验验证回补成功,且回补的SRSF9蛋白优势表达于细胞核。增殖和肿瘤干细胞成球实验证明回补的SRSF9可以拯救其功能(P<0.05)。结论SRSF9-sgMu成功在SRSF9基因敲除的U87单克隆细胞中回补SRSF9并拯救增殖和肿瘤干细胞成球功能。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 同义突变 基因回补 SRSF9 神经胶质瘤
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基于CRISPR/Cas9技术的法尼醇X受体缺失株的构建及其对HeLa细胞增殖的影响 认领
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作者 马方雪 安雅男 +7 位作者 王超 李媛 栾文静 王雪飞 倪丽慧 周宏 梁俊超 于录 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第2期450-456,共7页
试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建法尼醇X受体(FXR)基因稳定敲除细胞株,并考察其对HeLa细胞增殖的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计3对特异性识别FXR基因第1外显子相关序列的上下游小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),以P... 试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建法尼醇X受体(FXR)基因稳定敲除细胞株,并考察其对HeLa细胞增殖的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计3对特异性识别FXR基因第1外显子相关序列的上下游小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),以PX459质粒为载体,构建真核重组表达质粒。酶切和测序鉴定后将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,再用实时荧光定量PCR检测HeLa细胞FXR基因敲除稳定株中FXR的表达量,并用Western blotting方法鉴定HeLa细胞FXR基因敲除效果。最后用结晶紫染色试验检测FXR基因敲除对HeLa细胞增殖的影响。结果显示,经测序后,3对sgRNA位置与方向均正确插入到PX459质粒载体内,成功构建出重组表达质粒PX459-sgRNA;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,转染后筛选出的细胞中FXR蛋白不表达,表明构建出稳定敲除FXR基因的HeLa细胞株;结晶紫试验结果发现,FXR基因敲除的HeLa细胞染色深度明显低于正常HeLa细胞,FXR基因敲除HeLa细胞孔D 595 nm值极显著低于野生型HeLa细胞孔(P<0.01),说明HeLa细胞FXR基因敲除株的增殖能力较正常HeLa细胞显著降低。本试验利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源FXR基因敲除细胞株,且FXR基因敲除对癌细胞增殖具有显著抑制作用,为研究FXR的功能和作用机制提供了细胞模型,并为研究FXR在相关癌症发生发展中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 法尼醇X受体(FXR) HELA细胞 细胞增殖
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番茄过氧化氢酶CRISPR/Cas9敲除突变体的构建 认领
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作者 马铭悦 韩毅 《合肥工业大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2021年第1期112-117,共6页
番茄是一种重要的全球经济作物,其产量和品质往往受到病虫害的严重影响,因此获得抗病能力强的番茄新品种一直被认为是番茄稳产和高产的重要途径。光呼吸途径代谢产生的H2O2被广泛地认为是一种重要的抗病信号分子,然而能否提高番茄的抗... 番茄是一种重要的全球经济作物,其产量和品质往往受到病虫害的严重影响,因此获得抗病能力强的番茄新品种一直被认为是番茄稳产和高产的重要途径。光呼吸途径代谢产生的H2O2被广泛地认为是一种重要的抗病信号分子,然而能否提高番茄的抗病能力还不是很清楚。文章采用新型的基因编辑技术CRISPR/Cas9敲除番茄过氧化酶基因,该酶是清除H_2O_2的关键代谢酶,酶活测定显示成功获得7颗番茄过氧化氢酶下调突变体,该遗传材料为后续分析番茄抗病以及果实产量提供了宝贵的遗传资源。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 过氧化氢 过氧化氢酶 抗病分子 番茄
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鸡Apob基因组织表达与CRISPR/Cas9敲除系统的构建 认领
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作者 吉琳 杨秋月 +4 位作者 方斐旻 窦虹 郁建锋 徐璐 顾志良 《畜牧兽医学报》 CAS 北大核心 2021年第3期630-640,共11页
旨在探究Apob基因在鸡肝脂质代谢过程中的功能。本研究对鸡Apob蛋白进行理化性质分析;利用RT-qPCR检测Apob基因在4周龄黄羽肉鸡组织中的表达情况,每组设置3个重复,进行3次平行试验。根据鸡Apob蛋白关键结构域,在Apob基因外显子设计3对sg... 旨在探究Apob基因在鸡肝脂质代谢过程中的功能。本研究对鸡Apob蛋白进行理化性质分析;利用RT-qPCR检测Apob基因在4周龄黄羽肉鸡组织中的表达情况,每组设置3个重复,进行3次平行试验。根据鸡Apob蛋白关键结构域,在Apob基因外显子设计3对sgRNA,构建Cas/gRNA载体;将重组质粒转染DF-1细胞后,利用T7核酸内切酶I(T7 endonuclease I,T7EI)酶切法和TA克隆测序法筛选敲除活性位点并计算敲除效率。利用RT-qPCR检测基因敲除后亚克隆细胞中Apob基因mRNA表达情况。结果表明,鸡Apob的相对分子质量为523.356 ku,平均亲水性为-0.300,为稳定的蛋白质,并且该基因主要在鸡的肝、肾和小肠组织表达。敲除载体转染至DF-1细胞后,T7EI酶切发现,Cas/gRNA6、Cas/gRNA7和Cas/gRNA8三个位点均可发挥敲除活性,TA克隆测序结果表明,三者的敲除效率分别为33.3%、65%和80%。同时,RT-qPCR结果显示,转染Cas9/gRNA7、Cas9/gRNA6、Cas9/gRNA8的细胞中Apob基因mRNA表达水平约分别下调99.96%(P<0.01)、85%(P<0.01)、47%(P<0.05)。综上所述,本研究揭示了鸡Apob基因在组织中的表达特点和蛋白的理化性质;成功构建了鸡Apob基因CRISPR/Cas9敲除载体,并筛选出最佳敲除位点,获得了Apob基因敲除的亚克隆细胞,为进一步探索Apob基因在鸡肝中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 APOB基因 CRISPR/Cas9 脂质代谢
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新型基因编辑技术在单细胞微藻中的应用进展 认领
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作者 曹豪豪 张红兵 +3 位作者 薛溪发 李左群 闫洪波 李会宣 《生物技术进展》 2021年第1期9-15,共7页
微藻作为单细胞生物,广泛分布于海洋和淡水湖泊,由于其在生长过程中能在细胞内大量积累生物质,被应用于生物能源和高价值产品的生产。虽然微藻具有巨大潜力,但在现有研究中低脂质率等瓶颈问题仍未得到解决。近年来,基因工程技术尤其是... 微藻作为单细胞生物,广泛分布于海洋和淡水湖泊,由于其在生长过程中能在细胞内大量积累生物质,被应用于生物能源和高价值产品的生产。虽然微藻具有巨大潜力,但在现有研究中低脂质率等瓶颈问题仍未得到解决。近年来,基因工程技术尤其是新型基因编辑技术发展迅猛,基因组编辑技术快速、有效,有利于充分了解微藻的遗传和分子生物学信息,因此将其应用于微藻成为微藻基因工程和生物工程的热点领域,受到广泛关注。基于此,简要介绍了锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)、转录激活物样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和簇状规则间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas(CRISPR-associated systems)核酸酶系统等新型基因编辑技术,综述了上述技术在微藻中的应用进展,并对微藻基因编辑进行了展望,以期为深入了解和解决与微藻基因编辑有关的问题提供参考。 展开更多
关键词 基因编辑 微藻 ZFN TALEN CRISPR/Cas9
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)对小麦基因编辑效率的影响及转录组学分析 认领
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作者 代文双 刘会云 +2 位作者 杜庆国 邹枨 王轲 《生物技术通报》 CAS 北大核心 2021年第1期2-14,共13页
主要研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)与染色质状态以及CRISPR/Cas9的编辑效率之间的关系。利用不同浓度的尼克酰胺(0,2.5和5 mmol/L)和丁酸钠(0,5和10 mmol/L)对小麦幼苗处理7 d和14 d,结果显示丁酸钠处理会抑制幼苗的生长,而尼克酰... 主要研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)与染色质状态以及CRISPR/Cas9的编辑效率之间的关系。利用不同浓度的尼克酰胺(0,2.5和5 mmol/L)和丁酸钠(0,5和10 mmol/L)对小麦幼苗处理7 d和14 d,结果显示丁酸钠处理会抑制幼苗的生长,而尼克酰胺对幼苗影响较小。对尼克酰胺处理的小麦幼苗进行转录组测序,发现了一些有利于促进染色质状态开放的基因:6个甲基转移酶合成通路基因。此外对未发生编辑的TaAGO4a基因编辑转基因小麦材料的T2代进行尼克酰胺处理,结果显示5 mmol/L处理14 d时检测到1株3A和3B基因组均杂合编辑的植株,编辑效率从0提高到8.3%,其它处理组和对照组均没有检测到编辑。本研究证明尼克酰胺确实可以提高小麦基因编辑效率,为提高小麦基因编辑效率提供了一种新策略。 展开更多
关键词 小麦 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 染色质状态 CRISPR/cas9 转录组
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CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥BRI1突变体的鉴定 认领
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作者 武国凡 成宏斌 +2 位作者 吴玉俊 沈娟 吴旺泽 《植物研究》 CAS 北大核心 2021年第3期362-371,共10页
以拟南芥(Arabidopsis thaliana)油菜素内酯受体BRI1为目的基因,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定向编辑拟南芥BRI1,以期获得更多BRI1的突变体,为后续BRI1功能的进一步深入研究奠定基础。通过筛选转基因植株,对编辑后的BRI1进行测序分析,... 以拟南芥(Arabidopsis thaliana)油菜素内酯受体BRI1为目的基因,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定向编辑拟南芥BRI1,以期获得更多BRI1的突变体,为后续BRI1功能的进一步深入研究奠定基础。通过筛选转基因植株,对编辑后的BRI1进行测序分析,结果显示该突变体中BRI1基因序列由于新碱基的插入导致提前终止。同BRI1强突变体bri1-710一样,相比于野生型对照均对BL处理不敏感,但相比于bri1-710,该突变体植株较大,暗示BRI1 N端可能在BR信号途径中有重要作用。因此该研究可为后续进一步研究拟南芥及其他同源物种的BRI1功能提供可靠的参考依据。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因敲除 拟南芥 BRI1
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CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统在大豆中的应用 认领
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作者 关贝贝 王燕娟 +3 位作者 陈海峰 陈水莲 沙爱华 曹东 《中国油料作物学报》 CAS 北大核心 2021年第1期149-160,共12页
自CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)基因组编辑技术发现以来,迅速在作物中得到广泛应用。但是,CRISPR/Cas9多基因编辑系统在大豆中的研究尚待开发。本文利用CRISPR... 自CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)基因组编辑技术发现以来,迅速在作物中得到广泛应用。但是,CRISPR/Cas9多基因编辑系统在大豆中的研究尚待开发。本文利用CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统,分别构建了两个载体,一个载体含6个靶点,编辑7个大豆基因(4个Glycine max ASYMMETRIC LEAVES1(GmAS1)同源基因和3个GmAS2同源基因),另一个载体含8个靶点,编辑11个G.max AGAMOUS家族同源基因(4个GmAG同源基因,2个G.max SEEDSTICK(GmSTK)同源基因和5个G.max SHATTERPROOF1(GmSHP1/2)同源基因)。大豆遗传转化后,经表型鉴定和靶点检测发现,CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统在大豆中成功实现了多基因编辑。当3个GmAS1同源基因和3个GmAS2同源基因同时突变时,导致大豆叶片向远轴面弯曲、皱缩且叶柄变短的表型。当2个GmSHP1同源基因和2个GmSTK同源基因同时突变时,导致豆荚停止发育的不育表型。 展开更多
关键词 大豆 CRISPR/Cas9 GmAS1/2 GmSHP1/2 GmSTK 多基因编辑
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CRISPR/Cas9系统在水稻分子育种中的应用 认领
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作者 刘欣欣 李赫 +6 位作者 卜庆云 田晓杰 王臻昱 何明良 唐佳琦 李秀峰 孟威 《土壤与作物》 2021年第1期18-26,共9页
CRISPR/Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,其操作方便、效率高、成本低。水稻作为全球粮食安全的战略作物,优质高产的水稻培育尤为重要,CRISPR/Cas9技术为水稻分子育种带来了突破。本文回顾了基因编辑技术的发展,详细介绍了CRISPR/Cas... CRISPR/Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,其操作方便、效率高、成本低。水稻作为全球粮食安全的战略作物,优质高产的水稻培育尤为重要,CRISPR/Cas9技术为水稻分子育种带来了突破。本文回顾了基因编辑技术的发展,详细介绍了CRISPR/Cas9系统的结构、组成及原理,重点阐述了该技术在水稻分子育种中的应用,探讨CRISPR/Cas9系统存在的问题以及其在分子育种的发展前景。 展开更多
关键词 基因编辑 CRISPR/Cas9 水稻 分子育种
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GmGASA6基因CRISPR-Cas9载体构建及大豆的遗传转化 认领
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作者 张敏 徐胜利 +1 位作者 贺红利 刘剑锋 《吉林师范大学学报:自然科学版》 2021年第1期104-110,共7页
通过对大豆GmGASA6基因的结构分析,选择了两个靶位点构建了GmGASA6 CRISPR-Cas9的基因编辑载体.利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法进行了遗传转化,共转化外植体800个,获得了转基因阳性苗15株.通过测序证实部分T1代植株GmGASA6基因的靶... 通过对大豆GmGASA6基因的结构分析,选择了两个靶位点构建了GmGASA6 CRISPR-Cas9的基因编辑载体.利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法进行了遗传转化,共转化外植体800个,获得了转基因阳性苗15株.通过测序证实部分T1代植株GmGASA6基因的靶位点发生了基因编辑.与野生型相比,种子萌发实验发现突变体的胚根伸长受到显著抑制,说明在种子的萌发过程中GmGASA6基因促进种子萌发和胚根的伸长. 展开更多
关键词 GmGASA6 CRISPR-Cas9 载体构建 遗传转化 大豆
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gsdmd基因敲除巨噬细胞RAW264.7的构建:基于CRISPR/Cas9系统 认领
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作者 周丽婷 叶颖 +2 位作者 原海波 吴超逸 吴淑燕 《南方医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第1期116-122,共7页
目的利用CRISPR/Cas9系统构建gsdmd基因敲除的巨噬细胞RAW264.7,为研究gasdermin D(GSDMD)在巨噬细胞中的生物学功能提供细胞模型。方法针对gsdmd基因靶向设计4条向导RNA(sgRNA),构建pGL3-sgRNA串联载体后PCR、测序鉴定,将Cas9质粒和pGL... 目的利用CRISPR/Cas9系统构建gsdmd基因敲除的巨噬细胞RAW264.7,为研究gasdermin D(GSDMD)在巨噬细胞中的生物学功能提供细胞模型。方法针对gsdmd基因靶向设计4条向导RNA(sgRNA),构建pGL3-sgRNA串联载体后PCR、测序鉴定,将Cas9质粒和pGL3-sgRNA串联载体分两步电转至巨噬细胞RAW264.7;qPCR检测cas9的表达;嘌呤霉素筛选出阳性单克隆后PCR、Western blot和测序鉴定。将鼠伤寒沙门菌与gsdmd-/-RAW264.7细胞共培养,AnnexinⅤ/PI染色及比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放水平分析细胞死亡情况。结果qPCR结果表明获得稳定表达cas9的RAW264.7-Cas9细胞(P<0.01);PCR及测序证明pGL3-sgRNA串联载体构建成功;PCR、测序及Western blot结果表明成功构建gsdmd-/-RAW 264.7细胞。AnnexinⅤ/PI染色及LDH释放水平发现敲除gsdmd可降低巨噬细胞死亡率(P<0.01)。结论本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建gsdmd-/-RAW264.7细胞,为后续深入研究GSDMD介导的巨噬细胞死亡及其机制奠定基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 巨噬细胞 gasdermin D
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应用CRISPR/Cas9系统构建大肠埃希氏菌irp2基因缺失株 认领
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作者 富国文 单春兰 +4 位作者 敖平星 赵汝 高丽波 刘超英 高洪 《动物医学进展》 北大核心 2021年第1期50-55,共6页
CRISPR/Cas9是一个新兴的基因编辑技术,利用该技术对临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中的irp2基因进行编辑,为进一步研究该基因在致病中的作用提供基础。首先构建靶向irp2基因的sgRNA,PCR扩增上、下游同源臂,利用重叠PCR技术连接sg... CRISPR/Cas9是一个新兴的基因编辑技术,利用该技术对临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中的irp2基因进行编辑,为进一步研究该基因在致病中的作用提供基础。首先构建靶向irp2基因的sgRNA,PCR扩增上、下游同源臂,利用重叠PCR技术连接sgRNA与上、下游同源臂,再通过酶切与酶连构建出靶向irp2基因的pTargetF重组质粒。将pCas与pTargetF重组质粒转化临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中,成功构建了该菌株的irp2基因缺失菌株,为进一步研究其致病机制奠定基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 大肠埃希氏菌 irp2基因缺失菌株
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CRISPR/Cas9技术在猪常见病毒性疾病防控中的应用 认领
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作者 魏楠 谷峰 《中国兽医学报》 CAS 北大核心 2021年第2期366-372,共7页
CRISPR/Cas系统是一种存在于古生菌和细菌中重要的适应性免疫系统,CRISPR/Cas9技术可以实现对特定基因序列进行编辑,目前已经成为应用最广泛的基因编辑工具,利用其可以实现对病毒进行基因改造或解析宿主与病毒相互作用,优化疫苗生产和... CRISPR/Cas系统是一种存在于古生菌和细菌中重要的适应性免疫系统,CRISPR/Cas9技术可以实现对特定基因序列进行编辑,目前已经成为应用最广泛的基因编辑工具,利用其可以实现对病毒进行基因改造或解析宿主与病毒相互作用,优化疫苗生产和抗病毒动物分子育种等。猪作为我国最重要的食品动物,在国民经济和社会稳定中发挥着重要角色。非洲猪瘟疫情的暴发,使猪病毒性疾病成我国养猪业面临的主要问题,现总结了CRISPR/Cas9技术在猪常见病毒性疾病防控中应用,为猪病毒性疾病防控提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 猪病毒性疾病 非洲猪瘟 猪繁殖与呼吸综合征 伪狂犬病 猪病毒性腹泻 猪流感
基于细胞融合开发双基因共敲除技术 认领
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作者 于鲁孟 刘思思 +1 位作者 高晓冬 藤田盛久 《食品与生物技术学报》 CAS 北大核心 2021年第1期65-74,共10页
基因编码工具(例如CRISPR/Cas9)的出现使敲除哺乳动物细胞基因成为现实。然而,实现细胞的多基因敲除成功率低且所需时间长。细胞融合技术是构建杂合细胞的常用方法,通过融合两种不同表型的细胞,构建出一种具有杂合表型的新型细胞。但是... 基因编码工具(例如CRISPR/Cas9)的出现使敲除哺乳动物细胞基因成为现实。然而,实现细胞的多基因敲除成功率低且所需时间长。细胞融合技术是构建杂合细胞的常用方法,通过融合两种不同表型的细胞,构建出一种具有杂合表型的新型细胞。但是,由于基因的互补作用,通过基因敲除而获得的性状在细胞融合后成为隐性性状,融合细胞不能表现该性状。本研究的目的是设计一种通过细胞融合技术和CRISPR/Cas9技术获得基因双敲除细胞的方法。由于现阶段没有关于HEK 293细胞株细胞融合的参考数据,所以首先在HEK 293野生型细胞株中分别敲除GPI生物合成必需的PIGA或PIGK,获得PIGA-KO细胞株和PIGK-KO细胞株,并以这两个细胞株作为模型进行条件优化。经过反应条件优化,HEK 293细胞的融合效率显著提高,且实现了FUT8敲除细胞株和ST6GAL1敲除细胞株的快速融合;其次是将细胞融合技术与CRISPR/Cas9技术结合从而实现多种糖基因的快速敲除。将分别含有FUT8和ST6GAL1目标导向RNAs且都能稳定表达Cas9蛋白的两个细胞株进行融合,即可获得FUT8和ST6GAL1基因都被敲除的双敲细胞株。实验结果表明,将细胞融合技术和CRISPR/Cas9技术结合可简便而快速地获得基因双敲除细胞株。 展开更多
关键词 HEK 293 细胞融合 基因敲除 CRISPR/Cas9
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含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)对猪伪狂犬病毒复制的影响 认领
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作者 马英先 常雯茹 +7 位作者 张爽 翟云云 李佳佳 曾磊 李国利 明胜利 万博 杜永坤 《病毒学报》 CAS 北大核心 2021年第1期159-168,共10页
猪伪狂犬病是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种烈性接触性传染病,其感染宿主会触发机体先天免疫应答,引起I型干扰素(Type I interferon,IFN-1)和炎性细胞因子等细胞因子的产生,为研究可诱导产生炎性细胞因子的含半胱... 猪伪狂犬病是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种烈性接触性传染病,其感染宿主会触发机体先天免疫应答,引起I型干扰素(Type I interferon,IFN-1)和炎性细胞因子等细胞因子的产生,为研究可诱导产生炎性细胞因子的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)的基因敲除对PRV复制的影响,本试验利用近年来发展迅速的一项规律性短重复回文序列簇/Cas9核酸酶(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated system 9,CRISPR/Cas9)基因定点修饰技术构建猪肾上皮细胞(Porcine kidney epithelial cells,PK15)caspase-1基因稳定敲除细胞系,并通过T7核酸酶检测敲除效率;细胞毒性(Cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒检测PK15敲除caspase-1增殖影响;采用流式细胞术检测PRV-GFP感染PK15以及PK15-caspase-1^(-/-)的增殖差异;实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测PRV-gB、TK及白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IFN-β、干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes 20,ISG20)mRNA的表达;Western Blot检测PRV-gB蛋白表达;滴度测定检测子代病毒滴度。结果表明,2对特异性单链引导RNA(Single guide RNA,sgRNA)均能对caspase-1进行基因编辑,但经T7核酸酶酶切进行基因编辑效率分析结果表明sgRNA2的基因编辑效率较高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明caspase-1基因敲除对PK15以及PK15-caspase-1^(-/-)细胞活力无影响(P>0.05);流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-caspase-1^(-/-)中的增殖显著低于PK15细胞(P<0.05);定量RT-PCR结果表明PRV-gB、TK基因在PK15-caspase-1^(-/-)的mRNA表达显著低于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05),而IFN-β、ISG20基因在PK15-caspase-1^(-/-)的mRNA表达显著高于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05);Western Blot结果表明,PRV的gB蛋白在PK15-caspase-1^(-/-)的表达显著低于PK15细胞(P<0.05);滴度测定结果表明,敲除caspase-1能够抑制PRV子代� 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1) 猪肾上皮细胞(PK15) 猪伪狂犬病毒(PRV)
构建模拟人致病位点突变的靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统 认领
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作者 岳鹏鹏 黎成钦 +3 位作者 农月娟 陈玲 付灿 于鸿浩 《基础医学与临床》 2021年第3期325-332,共8页
目的建立可模拟人类KRT14强致病位点突变的高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统。方法本研究通过检索多个数据库筛查人类单纯性大疱性表皮松懈症(EBS)致病的基因KRT14强致病突变位点,并通过人和小鼠KRT14蛋白序列比对分析将筛查到的强... 目的建立可模拟人类KRT14强致病位点突变的高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统。方法本研究通过检索多个数据库筛查人类单纯性大疱性表皮松懈症(EBS)致病的基因KRT14强致病突变位点,并通过人和小鼠KRT14蛋白序列比对分析将筛查到的强致病位点定位于小鼠基因组上。根据CRISPR/Cas9系统的基因打靶原理,设计了4个靶向小鼠Krt14的单导RNA(sgRNA),并对应构建了4个sgRNA表达质粒。将sgRNA表达质粒分别与Cas9表达质粒共转染小鼠NIH 3T3细胞,转染细胞经过药物筛选、PCR扩增产物测序、TA克隆测序等实验验证4个sgRNAs的打靶效率。结果根据数据库筛查结果判定人KRT14蛋白的p.Arg125位点为强致病位点,与小鼠KRT14蛋白的p.Arg131位点相对应;根据小鼠p.Arg131位点的DNA序列,成功构建了4个靶向该位点的sgRNA表达质粒;药筛阳性细胞打靶位点的PCR扩增产物测序表明4个位点均发生了突变;TA克隆测序结果表明4个位点的突变效率分别为70%、90%、65%和100%。结论根据数据库筛查的人KRT14强致病位点,成功构建了高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统,为深入研究KRT14的功能以及建立KRT14基因编辑小鼠模型、探讨疾病的机制和治疗方法奠定基础。 展开更多
关键词 单纯性大疱性表皮松懈症 KRT14 基因编辑 CRISPR/Cas9
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CRISPR/Cas9基因编辑技术及应用研究概述 认领
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作者 冯江浩 魏思昂 +2 位作者 闫丽欢 崔洁 冯焱 《动物医学进展》 北大核心 2021年第3期123-126,共4页
CRISPR/Cas9是从细菌中发现的一种用Cas9核酸酶对外源DNA进行切割从而保护自身基因完整性的防御机制。通过对其结构中指导性RNA的改变即可便捷地对其识别位点进行改变,在基因编辑的应用方面具有很大潜力。论文主要概述CRISPR/Cas9系统... CRISPR/Cas9是从细菌中发现的一种用Cas9核酸酶对外源DNA进行切割从而保护自身基因完整性的防御机制。通过对其结构中指导性RNA的改变即可便捷地对其识别位点进行改变,在基因编辑的应用方面具有很大潜力。论文主要概述CRISPR/Cas9系统的组成、机制以及优缺点,同时介绍CRISPR/Cas9系统在科学研究、动物疾病治疗以及一些由基因改变导致的疾病模型方面的应用,对CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展进行预测。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因编辑 疾病模型 基因治疗
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诱导多能干细胞基因编辑的应用现状及展望 认领
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作者 周璨 杨利楠 +1 位作者 杨琨 刘琪 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2021年第25期4038-4044,共7页
背景:近年来,由于基因工程的进步,使细胞重编程成为可能,细胞DNA可以通过一些工具被操纵,如转基因、转录激活子样效应核酸酶、锌指核酸酶和CRISPR/Cas9。在细胞的重编程过程中,细胞首先转化为诱导多能干细胞状态,然后分化成所需的谱系,... 背景:近年来,由于基因工程的进步,使细胞重编程成为可能,细胞DNA可以通过一些工具被操纵,如转基因、转录激活子样效应核酸酶、锌指核酸酶和CRISPR/Cas9。在细胞的重编程过程中,细胞首先转化为诱导多能干细胞状态,然后分化成所需的谱系,从而产生大量的重编程细胞。自10年前诱导多能干细胞技术问世以来,干细胞生物学和再生医学取得了巨大的进步。人诱导多能干细胞现已被广泛用于疾病建模、药物开发和疾病的细胞治疗,同时诱导多能干细胞衍生产品的临床试验也已经启动。随着基因编辑技术的不断更新,诱导多能干细胞技术与基因编辑相结合,对疾病诱导多能干细胞进行基因编辑,校正致病突变并用于细胞治疗正成为转化医学和再生医学研究的热点。目的:通过对诱导多能干细胞特性及其与基因编辑结合应用的现状进行概括和总结,指导合适的方法进行疾病致病机制的研究与疾病的治疗。方法:由第一作者检索中国知网、中国生物医学文献数据库、爱思唯尔数据库、PubMed数据库2010至2020年相关文献。在标题、摘要、关键词中以"Induced pluripotent stem cells,CRISPR/Cas9,genome editing,disease modelling,drug development,regeneration"为关键词检索英文数据库;以"诱导多能干细胞,CRISPR/Cas9,基因编辑,构建模型,药物开发,再生"为关键词检索中文数据库。结果与结论:人诱导多能干细胞和CRISPR/Cas9基因编辑系统是基础研究和转化研究的2种工具,既可以深入了解许多疾病的分子基础,又可以开展药理研究。随着技术的不断发展与进步,诱导多能干细胞结合基因编辑在多个领域已开展起来,并取得了一定的研究成果。但该手段还存在不足,脱靶效应、分析成本高、基因编辑具有未知致病突变或风险变异及诱导多能干细胞植入体内突变风险都有待学者进一步解决。 展开更多
关键词 干细胞 诱导多能干细胞 CRISPR/Cas9 基因编辑 模型 药物开发 再生 综述
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基因编辑技术对大肠杆菌yjjW基因点突变的两步法策略 认领
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作者 张琦 梁雅静 +5 位作者 张宇馨 陈玲慧 韩钟娆 李贝贝 金一 何晓青 《微生物学报》 CAS 北大核心 2021年第1期183-194,共12页
【目的】为了实现对大肠杆菌靶基因的点突变,本研究将同源重组系统与CRISPR-Cas9技术相结合,探索一种高效、简捷的两步法策略。【方法】将靶基因的上下游同源臂和标记基因(amp)与pKOV质粒连接,获得pKOV-HR重组质粒。将pKOV-HR转化至大... 【目的】为了实现对大肠杆菌靶基因的点突变,本研究将同源重组系统与CRISPR-Cas9技术相结合,探索一种高效、简捷的两步法策略。【方法】将靶基因的上下游同源臂和标记基因(amp)与pKOV质粒连接,获得pKOV-HR重组质粒。将pKOV-HR转化至大肠杆菌,借助其自身RecA重组系统,介导DNA发生同源重组,获得靶基因敲除菌株。随后,靶基因的点突变采用pSGKP-km和pCasKP-apr双质粒系统。首先,设计与amp结合具有定向引导作用的spacer序列,并利用overlap PCR获得带有靶基因点突变的同源臂,将spacer和同源臂与pSGKP-km质粒连接,获得重组质粒pSGKP-km-spacer-HR;接着,将pSGKP-km-spacer-HR和pCasKP-apr质粒转化至上述敲除菌株;最后,利用质粒表达的Cas9切割蛋白和λ-Red重组蛋白,发生DNA同源重组,获得靶基因点突变菌株。【结果】利用上述方法,既成功获得了大肠杆菌yjjW敲除菌株D7ΔyjjW::ampR,又实现了yjjW第24位碱基T到C的点突变,获得点突变菌株D7yjjW-24。【结论】本研究建立了一种高效、简捷的大肠杆菌靶基因点突变方法,amp基因的插入提供了有效的筛选标记,此外该方法建立的重组质粒pSGKP-km-spacer,可应用于同种菌株其他靶基因的点突变,能够缩短后续实验操作,为基因编辑技术的发展提供了科学理论以及实验操作基础。 展开更多
关键词 CRISPR-Cas9 大肠杆菌 同源重组 点突变
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